Enzim sebagai Reagen Analitik dan Agen Terapi

1. Enzim sebagai Reagen Analitik

Penggunaan enzim sebagai reagen analitik dalam laboratorium klinik telah menemukan aplikasi yang tersebar luas dalam pengukuran substrat, obat-obatan dan aktivitas enzim lainnya. Di bagian atas, kita mendiskusikan funsgi enzim sebagai reagen dalam pengujian pasangan aminotransfer aspartat.

Prosedur ketergantungan enzim digunakan untuk menguji substrat seperti glukosa, urea, asam urat, dan kolesterol, menyediakan beberapa keuntungan dari proses kimia klasik. Keuntungan ini meliputi kekhususan substrat yang diukur dan pengukuran langsung dari substrat dalam gabungan yang lengkap untuk menghindari langkah pemisahan dan pemurnian serum.

Sebuah reagen enzim dapat digunakan dalam pengukuran substrat melalui 2 metode : pengujian titik akhir atau pengujian laju. Dalam pengujian titik akhir, substrat sudah secara lengkap berubah menjadi produk sebelum diukur; pada pengujian laju, perubahan dalam konsentrasi substrat diproduksi selama interval waktu yang diukur. Kedua metode ini mengarah pada metode kinetic 2 titik yang mana dilaksanakan di bawah kondisi konstan pH, temparatur, jumlah enzim dan interval waktu, menghasilkan nilai yang sangat akurat dari konsentrasi substrat.

Prosedur ini dikalibrasikan dengan larutan standar dari substrat. Tentunya kondisi reaksi pertama dengan kecurigaan terhadap substrat harus diutamakan dengan menjaga konsentrasi enzim reagen tinggi. Di bawah kondisi ini, ketika kecepatan rata-rata selama interval waktu yang diplotkan berlawanan dengan variasi konsentrasi substrat standar. Profil awal seharusnya menunjukkan garis lurus yang mana nilai yang tidak diketahui dapat dihitung.

Properti optikal dapat digunakan dalam memantau prosedur pengujian sebagaimana dalam aktivitas pengukuran enzim. Jika substrat primer atau produk tidak sesuai dengan properti optikal (misalnya absorbsi visibel atau cahaya ultraviolet), kemudian pengujian coupled dikonstruksi sehingga satu atau beberapa bantuan enzim yang bekerja untuk membentuk produk utama memiliki kemudahan diukur properti optikal.

Reaksi kedua (yang mana NADPH terbentuk) berfungsi sebagai reaksi indikator. Melalui reaksi hexokinase relative nonspesifik dan berekasi pada hexosa lain selain glukosa, untuk membentuk ester 6-fosfat, reaksi indiktor untuk glukosa 6-fosfat memiliki prosedur pengujian yang spesifik dan secara menyeluruh spesifik untuk mengikat glukosa.

Enzim yang dihentikan pada permukaan tidak larut dapat digunakan berulang kali dalam pengujian substrat. Pengujian jenis ini adalah mungkin bila hasil reaksi dapat dihitung secara langsung. Penghentian dapat disempurnakan melalui hubungan kimia meliputi kelompok diazo, triazine, dan azide dengan beberapa jenis matriz tak larut, seperti dietilaminoetilselulosa, karboksimetilselulosa, agarosa, mikrokristalin selulosa, dan dinding bagian dalam dari pipa plastik. Penghentian enzim pada permukaan bagian dalam dari pipa plastik berguna sekali pada berlangsungnya laju penganalisa. Reagen enzim yang telah dihentikan mencakup oksidasi glukosa, urea, alpha-amilase, tripsin dan leusinaminopeptida.

Reagen enzim dan antibodi dibentuk berlawanan molekul khusus dan dapat dikombinasikan untuk menentukan konsentrasi dari variasi molekul terhadap sebuah antibodi dapat dibentuk. Seperti prosedur analitik yang dikenal sebagai penguji imuno enzim (EIAs). Reagen enzim dapat dihubungkan dengan antibodi atau antigen seperti dalam proses kompleks imunologi atau aktivitas enzimatik. Antibodi dapat ditingkatkan pada vertebrata ketika diinjeksi dengan protein khusus (antigen) selain mereka. Makromolekul lainnya dibandingkan protein juga dapat menjadi antigenik. Senyawa berberat molekul rendah, (contohnya substrat, obat-obatan) melalui diri mereka sendiri tidak mendatangkan antibodi tapi tidak demikian jika kovalen dihubungkan dengan protein pembawa, (contohnya albumin) sebelum injeksi. Syarat hapten menandai substansi berberat molekul rendah dapat dikombinasikan dengan antibodi yang diproduksi melawan protein kompleks pembawa. EIAs bukan heterogenus atau homogenus.

Pengujian heterogenus terdiri dari sekurangnya satu langkah pembagian yang mana reagen berlabel disalin dari enzim tak berikatan, memungkinkan pengukuran salah satu ikatan atau aktivitas bebas. Prosedur yang berdasarkan prinsip ini adalah pengujian hubungan enzim immunosorbent (ELISA) yang mana dianalogikan pada RIA.

Metode ini terdiri dari pelapisan atau penyerapan antibodi yang dikembangkan dalam hewan, (contohnya babi guinea) melawan antigen manusia, yang konsentrasinya ditentukan dalam tes serum sampel. Di atas permukaan benda padat (contohnya, manik-manik atau dipermukaan bagian dalam dari pipa tes) dan yang diinkubasi dengan serum sampel. Selama langkah inkubasi pertama, anti gen mengombinasikan antibodi khusus dan diperbaiki untuk permukaan benda padat. Sesudah itu, komponen-komponen serum yang tidak bereaksi dipindahkan melalui aspirasi cairan. Permukaan padat yang mengandung kompleks antigen / antibodi dicuci dengan buffer yang sesuai. Inkubasi dengan kovalen antibodi dihubungkan dengan molekul enzim yang mengikuti.

Selama langkah ini, enzim antibodi berabel akan dikombinasikan dengan antigen tambahan; prosedur pencucian kemudian memindahkan konjugasi E-Ab non ikatan. Akhirnya, inkubasi dengan substrat tertentu untuk enzim menghasilkan produk berwarna yang dianalisis melalui metode spektrofotometri yang sesuai. Interval waktu untuk langkah inkubasi substrat dan kondisi reaksi lainnya harus dijaga agar konstan untuk kedua tes sera dan tes standar. Reaksi enzim akan dihentikan dengan perubahan pH reaksi penggabungan dengan menambahkan larutan garam. (Contohnya 1 N asam hidroklorid). Perubahan absorbansi warna yang sesuai untuk konsentrasi antigen dalam tes sera. Kura standar didapatkan melalui ploting konsentrasi antigen yang diketahui dengan absorbansinya.

Modifikasi yang beraneka ragam dari teknik ini digunakan sebagai contoh. Jika konsentrasi sebuah antibodi ditentukan, proses akan dimulai dengan penghentian pada antigen di atas fasa padat.

Enzim digunakan sebagai penanda seharusnya memiliki jumlah perputaran yang tinggi. Enzim bereaksi pada substrat yang stabil dan mudah larut, menghasilkan produk yang dapat dihitung dan dapat dihasilkan dalam tingkat kemurnian yang tinggi, dan relatif murah. Enzim yang memenuhi kriteria ini adalah peroksidase lobak, glukosa oksidase, phospat alkalin ekoli atau usus sapi, dan D-galaktosidase.

Hubungan kovalen dari enzim terhadap protein (antigen / antibodi) melewati kelompok amino bebas dapat disempurnakan dengan reagen glutarat difungsional. Metode oksida berkala meliputi sisi karbohidrat dari rantai protein juga menghasilkan kelompok reaktif yang berguna dalam preparasi enzim konjugasi. ELISA menunjukkan sensitivitas dan spesifikasi level tinggi yang mana cenderung pada faktor aplikasi yang diperkenalkan melalui cara aktivitas katalitik enzim berlabel, dapat dianalisis (dengan membandingkan ketelitian) yang didapat melalui RIA. Spesifitas adalah salah satu parameter untuk mengenali properti molekul khusus dari antigen dan antibodi. ELISA mungkin lebih berguna dibandingkan RIA karena reagen ELISA bisa bertahan hidup lebih lama dibandingkan beberapa radio isotop. (contohnya I – reagen berlabel) dan hadir dalam resiko tidak sehat. ELISA juga diadaptasikan untuk mengenal antigen dan atibodi dalam bagian jaringan melalui penggunaan konjugasi protein perokside.

Prosedur EIA homogenous memiliki manfaat yang istimewa dalam penentuan laju pada substansi berberat molekul rendah. Jadi protein ini memiliki bermacam aplikasi dalam menyelidiki terapi dengan tumbuhan dan toxikologi. Sebuah reagen komersil yang digunakan untuk uji dari banyak tumbuhan yang tersedia memiliki nama dagang EMIT (teknik zym multiplied immunoassay).

Prinsip dasar persaingan antara enzim label hapten dan hapten bebas dalam serum untuk pengikatan pada jumlah terbatas pada sebuah antibodi spesifik. Uji ini membutuhkan hubungan kovalen hapten untuk sebuah enzim (glikosa 6-fosfat dehidrogenase, lisosom atau malat hidrogenase) dengan aktivitas enzim tetap, dan hubungan kovalen hapten (diinjeksikan ke dalam hewan dari hapten kovalen linked untuk sebuah protein pembawa).

Aktivitas penghambatan enzim ketika mereka bercampur dengan kompleks enzim hapten linked mungkin memiliki halangan steric atau konformasi yang tidak bebas mengganggu jalan masuknya substrat ke pusat aktif. Sistem reaksi ini sesuai dengan tes. Contoh, enzim hapten berlabel, jumlah yang terbatas dari antibodi spesifik hapten dan substrat. Hapten lain muncul pada tes serum dan bersaing dengan hapten linked dari enzim untuk berkaitan dengan antibodi. Enzim hapten linked non ikatan bereaksi pada substrat untuk mengubahnya menjadi suatu produk yang mudah diukur. Jadi, aktivitas enzim ini secara langsung dikorelasikan dengan konsentrasi hapten bebas dalam tes specimen. Metode tersebut dikalibrasi dengan konsentrasi standar yang telah diketahui dari hapten.

System reseptor ELISA dan EIA mengukur konsentrasi substansi sangat rendah hingga beberapa nanograms (10-9 gram). Sensitifitas ini tidak cukup untuk mendeteksi beberapa substansi dan metode alternatif yang telah ditemukan salah satunya adalah CLIA yang mana dapat mengukur konsentrasi dalam femtogram. CLIA bergantung pada deteksi sinar yang dipancarkan dan diasosiasikan dengan penghilangan energi dari substansi elektronik sebagai akibat reaksi elektrokimia. Sebuah contoh dari bekas chemiluminescent adalah ester konjugasi dari acridinium, terhadap protein, polipeptida, dan molekul organik lainnya.

CLIA hampir sama dengan teknik EIA dan ELISA kecuali bahwa pengujian enzim reseptor akhir digantikan dengan bekas chemiluminescent diikuti oleh pengukuran dari emisi cahaya sebagai akibat dari reaksi kimia. Prinsip dari pengikatan kompetitif uji chemiluminescent.

2. Enzim sebagai Agen Terapi

Telah ditemukan beberapa aplikasi enzim sebagai agen terapi. Beberapa contoh yaitu transfuse darah segar, atau komponen aktifnya dalam pendarahan. Pengelolaan secara langsung dari enzim pencernaan dalam penyakit. (contohnya : cystic vibrosis) pengelolaan enzim vibrinolitik (contohnya : streptokinase) untuk meneruskan pembuluh darah yang tersumbat melalui trombi dalam trombombolic (contohnya penyumbatan paru-paru infraksi miokardial akut). Ancaman kekacauan tertentu dari kesalahan metabolisme sejak lahir. (contoh : penyakit gaucher), dan terapi kanker.

Untuk penggunaan enzim dalam terapi, mereka seharusnya mengambil sumber dari manusia, untuk menghindari masalah imunologica. Walaupun enzim didapatkan dari darah manusia mudah ditemukan namun enzim dari jaringan yang mana akan berfungsi, sementara dalam ancaman kesalahan metabolisme sejak lahir. Adalah sulit didapatkan dalam jumlah yang cukup. Transport enzim spesifik pada jaringan target juga menjadi masalah, tetapi beberapa kemajuan baru dan aplikasi komersil (contohnya : propagansi kultur jaringan sel manusia, isolasi dan cloning dari gen spisifik) berpotensial untuk mengatasi kesulitan ini.

Beberapa teknik telah digunakan dalam produksi hormone peptide seperti somatostatin dan insulin, interferon dan aktifator jaringan lasminogen. Dalam perlakuan dengan enzim atau protein, serangan kofalen dari polimer polietilenaglicol (PEG) tidak aktif atau lamban menyediakan beberapa keuntungan terapi. Ini termasuk memperlambat pembersihan dan pengurangan imunogenity menghindari degradasi dan pengikatan antibodi. Terapi enzim PEG digunakan dalam perlakuan penyakit imuno deficiensi, disebabkan oleh kekurangan adenosine diaminasi. PEG-interferon alfa complex, yang digunakan dalam perlakuan infeksi hepatitis c kronis. Bagaimanapun ketika sebuah gen dikloning teknik yang tadi akan dikembangkan untuk memasukkannya ke dalam genom dari manusia yang kurang atau memiliki mutasi gen.

Enzim sebagai Pengukur Radang Pankreas dan Kekacauan HatiEnzim untuk Mendeteksi Gangguan Organ Tubuh

This entry was posted in Enzim. Bookmark the permalink.